摘要

非线性显微镜被广泛用于表征厚的、光学不均匀的生物样品。定量图像分析需要准确描述起作用的对比度机制,但大多数已建立的数值模型忽略了近焦点样品非均匀性引起的场畸变的影响。在这项工作中,我们从实验和数值上证明了时域有限差分(FDTD)方法适用于模型聚焦场相互作用的非均匀性,典型的非线性显微镜。我们分析了指数不匹配介质(水、玻璃和脂类)之间普遍存在的垂直界面的几何形状,并考虑了双光子激发荧光(2PEF)、三次谐波产生(THG)和极化THG对比的情况。我们表明,FDTD模拟可以准确地再现在模型样本和活成年斑马鱼上获得的实验图像,而之前的模型忽略了微米尺度下折射率不匹配造成的场畸变。当解释相干和偏振分辨显微镜数据时,考虑这些效应显得特别关键。

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1.介绍

多光子显微镜(1广泛用于成像厚的生物样品。除了与深入成像的独特性能之外$ \ unicode {x00b5} {\ rm m ^ 3} $2、3光子激发荧光(2PEF, 3PEF) [2-5.],第二次和三次和三次谐波发电(SHG,THG)[6.-10]或相干拉曼反斯托克斯散射(汽车)[11].而对于基于2PEF(分别为3PEF)的荧光成像,信号被简单地描述为相应的平方。在依赖谐波产生或相干喇曼过程的相干非线性成像情况下,对比机制不太直观。在相干非线性显微镜中,信号和散射方向是激发场分布和样品微观结构相互作用的结果,因此定量图像解释需要建模。一种基于角谱表示(ASR)的仿真策略计算近焦点激励场分布,并利用格林函数将非线性响应从焦点区域传播到探测器平面,得到了广泛的应用[12-15].然而,该方法和其他大多数已建立的模型都忽略了焦点附近样品折射率不均一性的影响,而只关注非线性指数的分布。一个例外是垂直于传播方向的界面的特殊几何形状,在那里已经推导出了半解析解[1617].虽然近焦点线性传播效果通常被忽略了为了简单,但它可以被通知它们对多光子信号具有重要的影响,甚至更多的偏振分辨版本[1518-21].这在两个介电介质(例如水/脂质)之间的垂直界面附近特别预期,这恰好存在于生物样品的大多数显微镜图像中。

数值方法的最新发展已经开辟了对调查大深度的横梁传播等现象的有趣观点($ {\ gt} 100 \ \ unicode {x00B5} {\ rm m} $组织内部)。特别是图形处理单元(GPU)加速蒙特卡罗方法[2223或混合方法[2425]已经成功地为薄层荧光显微镜精确建模光束传播,尽管由于相位信息的损失,对点扫描非线性显微镜中使用的紧聚焦光束不适用。

沿着互补方向,已经使用有限差异的时间域(FDTD)方法来模拟几种显微镜技术,包括宽场,共焦和相位对比显微镜[26-28],以及最近用来计算光穿过骨骼时产生的像差[29]或脑组织[30.].最后,最近有利用FDTD的示威性,从理论上评估了索引失配对汽车和SHG显微镜信号电平的后果[3132],近场效果接近金纳米粒子[33].然而,这些研究没有包括实验验证,依赖于自定义FDTD实现,这阻碍了其他研究者的复制和扩展。

在这项工作中,我们从实验和数值上重新审视了使用非相干(2PEF)、相干(THG)和偏振分辨相干(P-THG)多光子显微镜成像的折射率不匹配介质之间常见的垂直界面几何形状。我们表明,ASR/Green模型不能再现实验观测结果,因为它忽略了近焦点的场畸变。相比之下,基于fdtd的方法可以准确地解释实验观测到的伪影,对相干和偏振分辨图像的解释具有重要意义。

2.方法

答:FDTD计算

我们概述了以下部分,用于FDTD和ASR /绿色计算的模型。用于生成数字的所有脚本和代码都在zenodo上使用[34].

FDTD系列的方法现在已经在几本书中记载了[3536]及评论[37],描述了具有它们的优缺点的不同实现及其限制。我们选择使用专为光子多发性计算(Lumerical Device Suite,Ansys Inc,Canonsburg,PA)为设计的标准实现,以促进进一步的比较。简而言之,通过求解离散的麦克斯韦方程[EQ,在连续时间计算电场和磁场。(1)]用于非磁性材料($ {var $} $ {var $} $ {var $} $ {var $} $).模拟在时域中执行,但可以在后处理步骤中使用傅立叶变换来检索光谱信息,

$$ \ optrightarrow \ nabla。\ optrightarrow d = \ over.Rightarrow 0; \ optrightarrow \ nabla。\超级arrow h = \ \ optrightarrow 0; \; \ frac {{\ partial \ overtrightarrow d}} {{\ partial t}} = \超级arraw \ nabla \ times \超级arrow h; \; \ frac {{\ partial \ overgredarrow h}} {{\ partial t}}} {{\ partial t}}} \ \ frac {1} {{{\ mu _0}}} \ overtrightarrow \ nabla \时代\超级arrow e。$$

我们进行了三种不同的FDTD计算,以估计(i)专注于垂直玻璃/水界面时的现场分布;(ii)由此产生的2pef信号假设水荧光;(iii)所产生的THG。我们认为具有中心波长的传入聚焦(NA = 1.0)高斯光束$ 1.2 \; \ unicode {x00b5} {\ rm m} $和50 nm的带宽,并在跨越焦点区域进行计算$ 18 \ times 18 \ times 13 \; \ Unicode {x00b5} {{\ rm m} ^ 3} $通过时间分辨率离散超过20-40纳米台阶\ \大约0.2美元;\ rm fs美元.由于存储整个模拟字段需要几十g字节,因此我们使用不同类型的监视器来保存相关数据来分析结果:

  • •对于线性(焦点场)模拟,我们求解了两种简单非色散材料($ {n_1},{甲烷}$)我们保存了时间集成的电场组件($ {E_x}, {E_y}, {E_z} $)对于包含预期焦点的3D卷。
  • •对于2PEF模拟,我们使用相同类型的材料进行了类似的计算,但我们使用了一个时间监视器来计算强度平方作为时间函数的积分。
  • •对于THG模拟,我们考虑了两种非线性材料,$({\ chi _1 ^ {(1)},\ chi _1 ^ {(3)}}),({\ chi _2 ^ {(1)},\ chi _2 ^ {(3)})$.在Lumerical软件形式主义中,明确地引入了一个非线性极化项,如下所示:$ {p_i}(t)= {\ varepsilon _0} \ chi _ {\ textit {ii}} ^ {(1)} {e_i}(t)+ {\ varepsilon _0} \ chi _ {\ textit {iii}} ^ {(2)} e_i ^ 2(t)+ {\ varepsilon _0} \ chi _ {\ textit {iiii}} ^ {(3)} e_i ^ 3(t)$美元我\ \ {x, y, z \} $).$ \ OverRightarrow D $定义为$ \ optrightarrow d(\ omega)= {\ varepsilon _0} \ overgrightarrow e(\ omega)+ \ optrightarrow p(\ omega)$.目前我们使用的软件版本的一个限制是非线性材料只能显示对角非零张量元素。为了模拟各向同性材料,我们因此设置$ \ chi _ {\ textit {xxxx}} ^ {(3)} = \ chi _ {\ textit {yyyy}} ^ {(3)} = \ chi _ {\ textit {zzzz}} ^ {(3)} = \ chi _0 ^ {(3)} $只考虑激发态沿$ {\ boldsymbol x} $或者$ {\ boldsymbol y} $.然后我们考虑了位于模拟区域末端的线性材料板上的二维探测器阵列,并计算了入射波长(385-415 nm)的1/3左右的积分强度。见图S1 in补充1对于接口THG的FDTD仿真域的原理图。

FDTD模拟运行在Dell Precision 7920 ($ 2 \ times $Intel 6140 CPU, 384gb RAM, DDR4 2666mhz)和Dell Precision 5820 (Intel Xeon W2175 CPU, 128gb RAM, DDR4 2666mhz)运行Lumerical 2019b或2020a的典型计算时间$ \约1 \! - \!2 \,\ rm h $每个条件。可视化1使用斐济语制作[38]和ClearVolume [39].

B. ASR /绿色模型计算

为了参考和比较,我们使用先前研究中描述的方法对来自相同几何的THG进行了基于ASR /绿色计算[121440].我们使用相同的形式来计算2PEF模拟的激发强度,并假设在这种情况下各向同性发射。

用于生成图形的MATLAB代码可在Zenodo [34].

C.显微镜

在配备有飞秒激光源(80MHz,1100nm,100 fs,Insight X3,Spectra Malecics,U.S)的正面实验室内置的多光子显微镜上进行实验,电流扫描仪(GSI Lumonics,U.)和水浸泡物镜($ 25 \ times $,1.05na,奥林巴斯,日本)。使用高Na冷凝器(OLYMPU)和UV滤波器(SEMROCK FF01-377 / 50)在透射中进行THG检测。用适当的过滤器(SEMROCK FF01-590 / 20)在EPI方向上检测到2PEF。使用光子计数探测器(Senstech,UK),实验室设计的计数电子产品和LabVIEW-写入软件(National Instruments,U.)进行检测。根据实验,我们在样品表面使用20-100兆瓦的激励力量。信号电平保存在避免检测链的饱和度的范围内,即每四个激光脉冲小于一个检测到的光子。入射偏振是线性的,并且使用位于目标前的旋转波形,其在焦平面中的方向控制,如[18].

用于生成图形的实验数据可在Zenodo上获得[34].

D.模型样本

为了获得明确定义的垂直界面,我们切割了一个石英幻灯片的一个边缘(厚度200美元\;\ unicode {x00B5} {\ rm m} $, SPI供应,美国)使用钻石刀。我们将盖玻片放在载玻片上,靠近一滴罗丹明B溶液($ 2.5 \; \ unicode {x00b5} \ rm g / ml $Sigma-Aldrich)。我们用一个样本170美元\;\ unicode {x00B5} {\ rm m} $厚硼硅酸盐玻璃盖(门泽尔,热科学门泽尔),让荧光溶液扩散和围绕石英幻灯片。230美元\;\ unicode {x00B5} {\ rm m} $在底部玻璃载玻片和硼硅酸盐盖玻片之间插入厚的垫片(Bytac Surface Protector,Saint-Gobain,法国),以确保其水平和最小化像差。

图:图1。

图1所示。ASR/Green和FDTD策略的原理用于非线性显微镜模拟,以及围绕近焦点垂直界面计算的激发强度分布。(a) ASR/绿色三步策略的示意图(见[1214]);(b) FDTD模拟的示意图:入射场传播到FDTD体积的开始(假设没有失真),然后这个初始分布以及诱导响应通过一个离散体积进行连续时间步长的数值传播;(c)用ASR公式计算的近焦点强度分布,假设入射波前没有畸变,忽略了焦点附近的指数不均一性;(d)用时域有限差分法计算类似光束传播时的近聚焦强度分布7美元\;\ unicode {x00B5} {\ rm m} $沿焦点附近的垂直界面。时域有限差分法预测了强局部畸变。比例尺= 1$ {} \ \ rm规模,酒吧= 1 \ \ \ unicode {x00B5}, {\ rm m} $.也可以看看可视化1

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图:图2。

图2所示。垂直石英/罗丹明界面非线性显微镜响应的实验与计算研究。(a)实验设置和几何形状。xy美元图像记录在连续的深度xz美元投影将在下面的展板中展示。(b)从左到右:在石英-罗丹明界面上实验测量的2PEF信号,放大xz美元在同一几何形状中查看,ASR /绿色和FDTD模拟2PEF。白色虚线表示石英盖玻片的顶部和侧边缘的位置。(c)从左到右:THG信号在Quartz-Rhodamine接口处实验测量,在同一几何形状中的ZOG的变焦视图,ASR / Green和FDTD模拟。白色虚线表示石英盖玻片的位置。黄色虚线管线表示5μm深度,曲线在面板(D)中提取。(d)(左)实验性THG在界面上扫描5μm的深度和相应的模拟;(右)以深度的函数测量和模拟横向位置的横向位置。比例条=$ 1 \,\,\ unicode {x00b5} {\ rm m} $

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在脂质/水实验中,油滴(橄榄油,普吉,法国)被嵌入琼脂糖凝胶中以防止运动。采用溶解法制备琼脂糖溶液美元1.0美元\;g低熔点琼脂糖粉(英杰公司9012-36-6)在加热下加入50ml蒸馏水,与油混合以产生乳液,并且在玻璃载玻片和盖玻片之间沉积小体积,用于成像。

E.斑马鱼成像

使用[中描述的协议进行实时成人斑马鱼成像41].12个月大的卡斯珀(山斑)斑马鱼[42]被用于这项研究。麻醉开始时将鱼浸泡在含有0.02% MS222 (Sigma-Aldrich)的水中90秒。然后将鱼转移到0.005% (v/v) MS222和0.005% (v/v)异氟烷的水溶液中以维持成像时的麻醉,并将其安装在塑料盘中,置于海绵之间。我们首先以拼接的方式记录了端脑上方和背部区域的皮肤和颅骨的大尺度THG图,以定位脂滴,然后记录了脂滴的P-THG图像。用激发物镜检测信号。总的来说,一次成像会议持续30-45分钟。所有动物实验都按照巴黎部门的官方监管标准进行(协议编号为A914772至N.D.),并符合法国和欧洲的伦理和动物福利指令(项目授权来自Ministère de l’enseement Supérieur,de la Recherche和de l 'Innovation to N.D.)。在成像斑马鱼之前,将淀粉颗粒成像为偏振参考(见图S2补充1).

F.图像分析

将不同偏振方向记录的THG图像转换成不同偏振方向记录的THG图像$xy - rm P$堆栈,可选去噪/去漂移步骤。然后用余弦平方函数拟合每个像素,提取调制的平均强度、振幅和相位(产生最大信号的偏振角)。保存拟合优度参数,并与平均强度和幅值一起生成二值掩模,然后应用于相位和幅值图可视化1.(见图S2 IN补充1有关图像分析工作流的概述)。用于图像分析的斐济宏也在Zenodo上[34].

结果

我们首先使用FDTD计算来评估光束在垂直界面附近所经历的场畸变。如图所示。1,我们首先考虑沿着水石英界面传播的紧密聚焦的高斯光束(NA = 1)。我们选择这些材料,因为它们的线性($ n \ = \ 1.33美元对于水,$ n \,= \,1.45 $对于石英)和非线性性质很好地描述了[43]在生物组织中发现了类似的指数不匹配。我们计算了强度分布,因为光束聚焦在样品表面下方7μm并横跨界面横向扫描。我们在从水域开始启动了FDTD计算unicode 7.5美元\;\ {x00B5} {\ rm m} $高于预期的焦点(即,距离界面500nm)并让光束通过一卷传播$ 24 \ times 24 \ times 12 \; \ Unicode {x00b5} {{\ rm m} ^ 3} $.我们扫描了界面之间的位置$y = - 5\;\unicode{x00B5}{rm m}$$y = + 5\;\unicode{x00B5}{rm m}$步长为250 nm。然后我们输出a中的时间平均强度分布$ 5 \ times 5 \ times 8 \; \ Unicode {x00b5} {{\ rm m} ^ 3} $理论焦点周围区域;结果如图所示。1(d)和可视化1.使用ASR模型和物镜上的扁平入射波前执行的等效计算如图4所示。1(c)进行比较。FDTD计算突出显示通过垂直界面扫描梁扫描的焦距场分布所经历的戏剧性扭曲,从水中的衍射限制点转换为接近界面的双峰分布,最后,以异常的焦点为特征在于通过石英域内的散焦和球面像差(可视化1).在样品中的千分尺尺度上发生的这种扭曲不通过简单的传播模型来计算[图。1(a)]在非线性显微镜研究中被很大程度上忽视。然而,我们可以预期它们对图像对比度有重要的影响,我们现在将证实这一点。

为了提供测试我们的模拟的基础事实,我们记录了石英和罗丹明 - 水溶液之间的垂直界面的2PEF和THG 3D图像(参见图。2).在xz美元重新注入,2pef [图。2(b)]和thg [图。2(c)]图像在界面附近表现出非竞争伪像,让人联想到图2所示的光束失真。1.然后我们研究了FDTD方法是否可以解释这些非线性响应,并首先模拟了一个2PEF过程,假设水中荧光团浓度均匀,玻璃中没有荧光。我们计算了荧光介质中强度的平方,并将这些值与模拟体积积分,以估计2PEF信号。我们扫描了一个区域$ x \ [- 6 \ \, \ unicode {x00B5} {\ rm m}; 6 \ \, unicode {x00B5} {\ rm m} \]美元在垂直界面的任意一侧$ z \ [unicode——\四\ \ {x00B5} {\ rm m}; 12 \ \, unicode {x00B5} {\ rm m} \]美元在水平界面周围深度[参见图42(b)对于圆偏振的情况的线性入射极化和图3的情况,以获得理论图像。作为参考,我们还基于ASR /绿色形式主义进行了数值模拟,忽略了近焦点的指数异质性。数字2(b)显示使用与最大图像强度的相同查找表的实验和数值数据。FDTD模拟与实验数据非常相似,并且精确地再现诸如界面附近强度的轴向减小的非轴向减小以及相对于界面的荧光最大值的横向移位。相比之下,当使用ASR /绿色形式主义时,不会再现这些实验观察的伪像[图。2(明亮的]。

然后,我们将模拟适应于相干非线性过程的情况,例如THG [图。2(c)]和shg(图S4补充1).我们对THG进行了FDTD计算xz美元包含两种非线性材料的图像${\气^ {(3)}}$被认为是$ 1.68 \ times {10 ^ { - 5}} $用于水和$ 2 \ times {10 ^ { - 5}} $对于石英,为了保持两种材料之间的比例与实验报道的非线性磁化率一致[43].我们在模拟体积的末端监测了方形阵列的方形阵列中的光谱,并将数值检测器放置在大于波长的线性材料内,以避免近场效果(见图S1)补充1有关模拟的详细原理图)。数字2(c)显示了界面的实验THG图像以及相应的ASR/Green和FDTD仿真。ASR/Green函数模拟在水平和垂直界面预测了一个简单的单峰信号,FDTD模拟准确地再现了实验观察到的THG最大值在石英材料外的侧向位移,以及从一个深度开始的第二个侧向峰值的出现$ z \约5 \,\,\ unicode {x00b5} {\ rm m} $沿垂直界面。

图:图3。

图3所示。两各向同性介质界面的P-THG响应。(a)实验几何:在物镜前安装一个旋转波片,用来控制入射线偏振的方向xy美元飞机。(b)xz美元垂直水-石英界面P-THG图像的投影。从上到下:THG强度在所有入射偏振上平均;提供最强THG的面内偏振角;P-THG调制定义为当入射偏振为$ x $$ y $.从左到右:实验数据;放大模拟对应的区域;FDTD计算;ASR /绿色计算。$ {\ rm scale \,bars =} 1 \; \ unicode {x00b5} {\ rm m} $

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图:图4。

图4所示。琼脂糖中固定的油滴的P-THG。(a)实验的几何形状;(b)左:原始实验ZHG$ x $- 散对和$ y $- 振荡刺激;右:使用FDTD和ASR /绿色模型的实验数据和相应的模拟。显示(顶行)的强度映射对应于入射极化旋转时的平均THG强度。xy美元平面,幅度映射(中间行)对应于依赖于偏振方向的THG信号的分数,并且角度映射(底行)对应于产生最大THG信号的偏振方向。$ {\ rm scale \,bar} = 5 \,\,\ unicode {x00b5} {\ rm m} $;(c)沿(b)所示的虚线的THG强度的简档,用于沿着事件偏振$ x $$ y $方向和相应的FDTD计算显示定量协议。

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图:图5。

图5所示。现场成人斑马鱼中的脂液滴的P-THG成像。左:(a)实验几何形状和(b)在约50μm的深度记录的背部区域的图像。比例栏,200美元\;\ unicode {x00B5} {\ rm m} $;右图:放大的大型($ \大约12 \,\,\ unicode {x00b5} {\ rm m} $半径)脂质液滴,具有相应的P-THG调制和角度图。FDTD和ASR /绿色计算对应于a15美元\、\ \ unicode {x00B5} {\ rm m} $显示水中的直径球形油滴以进行比较。$ {\ rm scale \,bar} = 5 \; \ unicode {x00b5} $.另见图。S5 IN补充1

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然后我们研究了偏振解析非线性显微镜下FDTD策略的相关性。SHG、THG或CARS信号的偏振特性越来越多地用于探测微米尺度的材料特性[1519-21].然而,这种方法需要适当的模型来准确地解释测量结果。因此,我们分析了入射极化对垂直界面产生的THG信号的影响。作为提醒和参考,过去的理论研究使用ASR/Green形式预测,从各向同性介质垂直界面的THG信号应该显示$ 10 \! - \!15 \%$光强随入射线偏振的旋转而变化xy飞机(12].我们重新回顾了我们的石英-水界面实验,记录了沿界面连续深度偏振相关的THG图像。后(20.[我们对P堆叠进行了简化的分析,以提取P-THG调制幅度的图(“$ p $.-thg调制“定义为$({i _ {{\ max}}} - {i _ {{\ min}}})/ {i _ {{\ max}}} $)和导致最大THG(“P-THG角”)的偏振角。结果如图所示。3.(a),以及相应的FDTD和ASR/Green计算。由于我们目前的FDTD实现只允许对角非线性张量元素,我们模拟了沿沿入射偏振连续入射的界面的非线性响应$ x $轴和$ y $根据实验数据,假设最大信号沿这两个轴中的一个,我们从中估计出调制幅度和最大信号的角度。

一个第一个引人注目的观察是实验测量的p-thg调制是$ \约45 \%$在所有深度上对a积分$ 1 \; \ unicode {x00b5} {\ rm m} $距离。该值远大于ASR /绿色模型预测,但通过FDTD计算准确估计。而且,当ASR /绿色模型预测当入射极化与垂直接口平行时,应观察到最大THG [参见[12)和无花果。3.(A)],当使用FDTD方法垂直于接口时,实验观察到的THG实际上最大化了。这种行为最有可能从根本和谐波波长的索引不匹配中产生,导致修改的对比机制。当在样本光学特性方面解释偏振数据时,当然应该适当地建模在各向同性介质之间的界面处的强烈极化响应。

然后,我们分析了模型样本更紧密地模仿生物样品。为此目的,我们录制了来自油滴的P-THG调制和角度映射($ \大约6 \ \ \ unicode {x00B5} {\ rm m} $在低浓度琼脂糖凝胶中固定(图。4.).水和橄榄油的线性和非线性性质是已知的[43,这样可以与模拟进行定量比较。我们一致地观察到在$ 55 - 60 \ % $范围 ($ 57 \ PM 6 \%,n = 5 $),极化与液滴表面正交时,录得最大THG信号。FDTD计算准确地再现了这两种现象,但ASR/Green计算却忽略了这两种现象[图]。4.(b),最后一列)。

最后,为了确认我们的建模方法与生物成像的一般相关性,我们记录了麻醉成年斑马鱼脂滴的P-THG图像。数据5.和S5.显示具有代表性的图像$10 - 15\,\,\unicode{x00B5}{rm m}$液滴位于背部和头部皮肤下50-100µm。这些实验让人想起了对模型油滴的测量:脂滴在活的有机体内产生的P-THG调制范围为30%和60%,并且对于与液滴表面正交的偏振,观察到具有最大THG的径向角度曲线。注意,在脂质液滴上观察到的P-THG调制在活的有机体内与前图中考虑的油滴在水中的模型情况相比,表现出更多的非均质性。这可能是由多种因素造成的,包括斑马鱼脂滴的不同组成和光学特性,它们的非完美球形形状和亚微米尺度下可能的不均一性,以及在光照较低的实时图像中较低的信噪比,以最大程度地减少光毒性。尽管如此,P-THG调制振幅和角度观测在活的有机体内再次与FDTD计算一致,并且不能用ASR /绿色模型再现,假设这些液滴由水包围的各向同性脂质样介质组成(图。5., 剩下)。

4。讨论

总之,我们已经表明,基于焦点区域中FDTD的模拟策略可以准确地描述具有不同线性特性的非线性材料之间垂直界面的非线性显微镜响应。我们选择了一般的几何形状和特征性的材料(水,脂质和玻璃n美元从1.33到1.47),以便我们可以确认对显微镜数据的定量分析的方法的相关性。我们发现常用的仿真策略在再现在与2PEF,THG和P-THG成像上成像的垂直接口上进行实验观察到的伪像的仿真策略。我们估计,当解释Polariemetric显微镜数据时,这可能是ASR /绿色模型的一个主要限制。实际上,水性和脂质结构之间的垂直界面存在于大多数细胞和组织显微镜图像中。

我们指出,这里所考虑的几何和光学指数变化在许多生物样品中都遇到过类似的空间尺度。事实上,脂质结构如囊泡和髓磷脂是THG造影剂的重要来源[1044],通常大小在0.1 - 20µm之间,而结缔组织和骨骼[45]也表现出很大的索引不匹配(到$ n = 1.55美元)在类似的尺度上。幸运的是,我们发现FDTD方法显示为一个非常适合的互补数值框架,以调查在这种情况下的复杂对比,有可能使我们能够从图像中提取更多信息。例如,我们预计FDTD模拟将提供一种更好地理解线性(指数失配,双折射)和非线性的贡献的方法(${\气^ {(3)}}$张量对称)索引失配对象的偏振分辨成像中的对比度来源[18].更普遍地说,我们的发现对分析在存在局部折射率不匹配的情况下记录的荧光图像具有重要意义,而且最有可能的是,对涉及多个激发光束的非线性技术的开发,如相干喇曼显微镜[31].

资金

法国癌症防治协会国家情报局(ANR-10-INBS-04,ANR-10-LABX-0073,ANR-15-CE11-0012,ANR-EQPX-0029)。

承认

我们感谢光学与生物科学实验室的先进显微镜小组和斑马鱼神经遗传学单位的所有成员就多光子显微镜进行科学讨论。我们特别感谢Marie-Claire Schanne-Klein对论文的校对,感谢Emilie Menant对斑马鱼的饲养,感谢Laure Bally-Cuif和Sebastien Bedu对鱼类饲养的建议。

披露的信息

作者声明没有利益冲突。

数据可用性

有关资料(试验资料及程式)可于[34].

补充文件

补充1用于支持内容。

参考文献

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补充材料(2)

的名字 描述
»补充1 补充数据S1-S5
»可视化1 PSF通过垂直水-石英界面传播时的3D渲染。(FDTD模拟)

数据可用性

有关资料(试验资料及程式)可于[ 34].

34。J. Morizet, G. Sartorello, N. Dray, C. Stringari, E. Beaurepaire,和N. Olivier,“FDTD用于NL显微镜,”Zenodo (2021),http://doi.org/10.5281/zenodo.4722857

引用的

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数字(5)

图1所示。
图1所示。ASR/Green和FDTD策略的原理用于非线性显微镜模拟,以及围绕近焦点垂直界面计算的激发强度分布。(a) ASR/绿色三步策略的示意图(见[1214]);(b) FDTD模拟的示意图:入射场传播到FDTD体积的开始(假设没有失真),然后这个初始分布以及诱导响应通过一个离散体积进行连续时间步长的数值传播;(c)用ASR公式计算的近焦点强度分布,假设入射波前没有畸变,忽略了焦点附近的指数不均一性;(d)用时域有限差分法计算类似光束传播时的近聚焦强度分布 7美元\;\ unicode {x00B5} {\ rm m} $ 沿焦点附近的垂直界面。时域有限差分法预测了强局部畸变。比例尺= 1 $ {} \ \ rm规模,酒吧= 1 \ \ \ unicode {x00B5}, {\ rm m} $ .也可以看看 可视化1
图2所示。
图2所示。垂直石英/罗丹明界面非线性显微镜响应的实验与计算研究。(a)实验设置和几何形状。 xy美元 图像记录在连续的深度 xz美元 投影将在下面的展板中展示。(b)从左到右:在石英-罗丹明界面上实验测量的2PEF信号,放大 xz美元 在同一几何形状中查看,ASR /绿色和FDTD模拟2PEF。白色虚线表示石英盖玻片的顶部和侧边缘的位置。(c)从左到右:THG信号在Quartz-Rhodamine接口处实验测量,在同一几何形状中的ZOG的变焦视图,ASR / Green和FDTD模拟。白色虚线表示石英盖玻片的位置。黄色虚线管线表示5μm深度,曲线在面板(D)中提取。(d)(左)实验性THG在界面上扫描5μm的深度和相应的模拟;(右)以深度的函数测量和模拟横向位置的横向位置。比例条= $ 1 \,\,\ unicode {x00b5} {\ rm m} $
图3所示。
图3所示。两各向同性介质界面的P-THG响应。(a)实验几何:在物镜前安装一个旋转波片,用来控制入射线偏振的方向 xy美元 飞机。(b) xz美元 垂直水-石英界面P-THG图像的投影。从上到下:THG强度在所有入射偏振上平均;提供最强THG的面内偏振角;P-THG调制定义为当入射偏振为 $ x $ $ y $ .从左到右:实验数据;放大模拟对应的区域;FDTD计算;ASR /绿色计算。 $ {\ rm scale \,bars =} 1 \; \ unicode {x00b5} {\ rm m} $
图4所示。
图4所示。琼脂糖中固定的油滴的P-THG。(a)实验的几何形状;(b)左:原始实验ZHG $ x $ - 散对和 $ y $ - 振荡刺激;右:使用FDTD和ASR /绿色模型的实验数据和相应的模拟。显示(顶行)的强度映射对应于入射极化旋转时的平均THG强度。 xy美元 平面,幅度映射(中间行)对应于依赖于偏振方向的THG信号的分数,并且角度映射(底行)对应于产生最大THG信号的偏振方向。 $ {\ rm scale \,bar} = 5 \,\,\ unicode {x00b5} {\ rm m} $ ;(c)沿(b)所示的虚线的THG强度的简档,用于沿着事件偏振 $ x $ $ y $ 方向和相应的FDTD计算显示定量协议。
图5所示。
图5所示。现场成人斑马鱼中的脂液滴的P-THG成像。左:(a)实验几何形状和(b)在约50μm的深度记录的背部区域的图像。比例栏, 200美元\;\ unicode {x00B5} {\ rm m} $ ;右图:放大的大型( $ \大约12 \,\,\ unicode {x00b5} {\ rm m} $ 半径)脂质液滴,具有相应的P-THG调制和角度图。FDTD和ASR /绿色计算对应于a 15美元\、\ \ unicode {x00B5} {\ rm m} $ 显示水中的直径球形油滴以进行比较。 $ {\ rm scale \,bar} = 5 \; \ unicode {x00b5} $ .另见图。S5 IN 补充1

方程式(1)

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D. = 0. H = 0. D. T. = × H H T. = 1 μ. 0. × E.

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